Thuốc thử phát hiện Bacillus anthracis trong thịt, sản phẩm thịt?

1. Môi trường nuôi cấy và thuốc thử phát hiện Bacillus anthracis trong thịt, sản phẩm thịt?

Trong Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5154:2009, điều quan trọng nhất khi thực hiện việc phát hiện Bacillus anthracis trong thịt và các sản phẩm thịt là đảm bảo môi trường nuôi cấy và thuốc thử phù hợp. 

- Yêu cầu tổng quát: Trước hết, việc thực hiện các thí nghiệm phải tuân theo các hướng dẫn được quy định trong TCVN 6404:2008 (ISO 7218:2007), đảm bảo tính chính xác và đồng nhất trong quy trình thử nghiệm.

- Môi trường nuôi cấy chứa các dưỡng chất cần thiết: Một trong những yếu tố quan trọng là môi trường nuôi cấy phải cung cấp đầy đủ các dưỡng chất cần thiết. Các chi tiết về môi trường này có thể được tìm thấy trong phần C.1 của tiêu chuẩn.

- Sử dụng môi trường thạch dinh dưỡng: Đối với một số trường hợp cụ thể, môi trường thạch dinh dưỡng cùng với việc bổ sung 0,7% natri bicacbonat là lựa chọn phù hợp. Thông tin chi tiết về loại môi trường này có thể được tìm thấy trong phần C.2 của tiêu chuẩn.

- Môi trường thạch máu: Để tạo điều kiện lý tưởng cho việc phát hiện, một phần quan trọng là sử dụng môi trường thạch máu. Thông tin chi tiết về loại môi trường này có thể được tìm thấy trong phần C.3 của tiêu chuẩn.

- Huyết thanh lắng cặn (kháng thể chuẩn), kháng nguyên âm tính chuẩn và kháng nguyên dương tính chuẩn (vacxin Sterne): Để chuẩn bị huyết thanh lắng cặn và các kháng thể chuẩn, quy trình bao gồm tiêm vacxin Sterne dưới da vào ngày thứ nhất và ngày thứ 14 vào thỏ. Đảm bảo sự chuẩn xác và đồng nhất trong quy trình thử nghiệm.

- Nước muối đẳng trương: Nước muối đẳng trương được sử dụng để tạo điều kiện môi trường phù hợp cho việc thực hiện các thí nghiệm. Thông tin chi tiết về nước muối này có thể được tìm thấy trong phần C.4 của tiêu chuẩn.

- Thuốc nhuộm gram và thuốc nhuộm Wright: Các loại thuốc nhuộm này được sử dụng để nhuộm mẫu để tạo điều kiện thuận lợi cho việc quan sát và phân biệt các tế bào vi khuẩn. Thông tin chi tiết về cách sử dụng chúng có thể được tìm thấy trong phần C.5 và C.6 của tiêu chuẩn tương ứng.

2. Thực hiện lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5154:2009

Trong Mục 7 của Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5154:2009, các yêu cầu về việc lấy mẫu được quy định như sau: Việc lấy mẫu không được cụ thể hóa trong tiêu chuẩn này. Tuy nhiên, để đảm bảo tính đại diện và chất lượng của mẫu, việc lấy mẫu cần tuân theo các quy định trong TCVN 7925:2008 (ISO 17604:2003) và các tiêu chuẩn cụ thể liên quan.

Tuy nhiên, điều quan trọng nhất không chỉ là việc tuân thủ các quy trình lấy mẫu chuẩn mực mà còn là đảm bảo rằng mẫu thu được là mẫu đại diện, không bị biến đổi hoặc mất chất lượng trong quá trình vận chuyển và bảo quản. Đặt ra một thách thức đối với người thực hiện, đòi hỏi sự cẩn trọng và chuyên môn cao để đảm bảo sự chính xác và đáng tin cậy của kết quả thử nghiệm,

Trong Mục 8 của Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5154:2009, các yêu cầu về việc chuẩn bị mẫu thử được quy định như sau:

- Nguyên tắc chung: Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân cần tuân thủ nguyên tắc chung được quy định trong TCVN 6507-2:2005 (ISO 6887-2:2003). Đảm bảo rằng quy trình chuẩn bị mẫu được thực hiện một cách chính xác và đồng nhất, từ đó giúp đảm bảo tính chính xác của kết quả kiểm tra vi sinh vật.

- Để chuẩn bị mẫu các sản phẩm cụ thể theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5154:2009, các quy trình cụ thể như sau:

+ Sản phẩm tươi sống: Đối với mẫu thử là hạch, trước tiên cần bổ đôi hạch để thu được mẫu. Đối với các mẫu thử khác, sử dụng dao mổ đã được hơ nóng trên ngọn lửa. Áp dao nhanh lên mặt của mẫu thử tại vị trí có dấu tích bệnh. Tiếp theo, trích sâu mũi dao vào vùng đã xử lý và sử dụng que cấy để lấy mẫu. Đảm bảo rằng mẫu thử được lấy mẫu một cách chính xác và đủ đại diện.

+ Sản phẩm khác (bao gồm sừng, rơm, cỏ): Đối với các sản phẩm khác, cần cân từ 5 g đến 10 g mẫu thử. Tiếp theo, cắt hoặc nghiền vụn mẫu thử thành mảnh nhỏ hoặc hạt nhỏ hơn. Sau đó, ngâm mẫu trong nước muối đẳng trương vô khuẩn với tỉ lệ từ 5 phần đến 10 phần. Mẫu được để ở nhiệt độ phòng trong khoảng từ 4 đến 5 giờ, và sau mỗi 30 phút, mẫu được lắc nhẹ trong khoảng 2 đến 3 phút. Lớp nước trên cùng sau đó được thu lấy. Trong trường hợp nghi ngờ về sự nhiễm tạp khuẩn, mẫu cần được đun nóng trên nồi cách thủy ở nhiệt độ 65°C trong khoảng từ 15 đến 30 phút.

+ Sử dụng que tăm bông ướt vô khuẩn để quét mẫu thử trên các vị trí khác nhau và cả hai mặt của mẫu. Sau đó, que tăm bông được chuyển vào bình đã chuẩn bị trước đó, chứa từ 20 ml đến 50 ml môi trường nước thịt. Bình chứa mẫu được đặt trong điều kiện ủ ở nhiệt độ 37°C trong khoảng thời gian 24 giờ.

Quy trình này không chỉ giúp thu thập mẫu một cách đồng nhất và hiệu quả mà còn tạo điều kiện lý tưởng cho sự phát triển của vi khuẩn trong môi trường nước thịt. Tăng cường khả năng phát hiện và đánh giá mức độ nhiễm bẩn trong mẫu thử một cách chính xác và đáng tin cậy.

3. Tiến hành phương pháp phát hiện Bacillus anthracis trong thịt, sản phẩm thịt

Trong Mục 9 của Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5154:2009, các quy định về cách tiến hành được mô tả như sau:

* Yêu cầu chung: Đảm bảo rằng dụng cụ, môi trường và thao tác đều phải được thực hiện trong điều kiện vô khuẩn và an toàn, đồng thời tránh gây ô nhiễm. Quy trình này nên được thực hiện trong phòng thí nghiệm thông thường, tuân thủ theo hướng dẫn trong TCVN 6404:2008 (ISO 7218:2007).

* Ủ và cấy: Sử dụng que cấy vòng vô trùng hoặc tăm bông để ria cấy dung dịch huyền phù ban đầu hoặc mẫu máu, dịch lấy từ vết rạch của mô hoặc phủ tạng lên môi trường thạch dinh dưỡng và thạch máu. Mỗi loại mẫu cần được cấy trên hai đĩa. Đặt vào môi trường chứa polymyxin (100 000 UI/I) để giảm sự nhiễm khuẩn và giúp phân lập được B. anthracis.

* Nhận dạng B. anthracis: Ủ các đĩa đã cấy ở 37°C qua đêm để phát hiện sự có mặt của các khuẩn lạc B. anthracis giả định dựa trên các đặc trưng của chúng. Tiến hành nhuộm Gram và Wright để nhận dạng chính xác. Vi khuẩn B. anthracis sản xuất giáp mô, một yếu tố độc lực có khả năng ngăn chặn sự phân chia của tế bào, đặc biệt là trong cơ thể của gia súc mắc bệnh. Tính chất này của giáp mô có thể mất đi khi vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường nhân tạo với điều kiện hiếu khí.

- Để tạo ra giáp mô, vi khuẩn B. anthracis cần được nuôi cấy trong môi trường máu ngựa đã được tách fibrin hoặc trong môi trường có bổ sung natri bicacbonat 0,7% ở nhiệt độ 37°C, với bổ sung khí CO2 20%. Giúp vi khuẩn phát triển mạnh và sản xuất giáp mô, dẫn đến sự hình thành của những khuẩn lạc nhầy. Sử dụng tăm bông ướt vô trùng để quét mẫu thử ở nhiều vị trí khác nhau và cả hai mặt của mẫu. Sau đó, chuyển tăm bông vào bình chứa từ 20 ml đến 50 ml canh thang dinh dưỡng và ủ mẫu ở 37°C trong thời gian 24 giờ.

- Trên môi trường thạch dinh dưỡng hoặc thạch máu, mẫu thử sẽ hình thành những khuẩn lạc mờ, khá phẳng, với kích thước nhỏ hơn so với B. cereus, khoảng từ 0,3 cm đến 0,5 cm. Chúng có đặc tính nhầy và dính hơn, đồng thời trên thạch máu, chúng có màu trắng xám hoặc xám và thường hình thành các sợi dài giống như sợi tóc xoăn. Ria cấy mẫu trên môi trường mạch máu và thạch dinh dưỡng, mỗi loại mẫu sẽ được cấy trên hai đĩa riêng biệt. Sau đó, ủ mẫu ở 37°C trong 24 giờ trước khi đọc kết quả và thực hiện làm đồ phiến nhuộm Gram và Wright để phân biệt và nhận diện vi khuẩn.

- Khuẩn lạc B. anthracis, trong hình dạng điển hình, thường có hình dạng tròn, lớn, và có màu trắng đục, với bề mặt nhầy và rìa mép nhăn theo. Dưới kính hiển vi, chúng thường xuất hiện như những hình sóng với các nếp xoắn quanh khu vực trung tâm, giống như tóc uốn, và không tan vào máu. Trên lam kính, vi khuẩn thường có hình dạng bầu dục và có nha bào ở giữa thân.

- Chọn những khuẩn lạc có đặc điểm trên và cấy chúng sang môi trường nước thịt. Sau đó, ủ mẫu ở 37°C trong khoảng thời gian từ 18 đến 24 giờ. Khi đọc kết quả, mẫu nước thường xuất hiện với những sợi xốp như bông, màu trắng đục, và sau khi lắng xuống đáy ống, phần nước bên trong sẽ trở nên rõ ràng hơn. Trong trường hợp phát hiện sự hiện diện của tạp khuẩn, quy trình sẽ được lặp lại bằng cách cấy ria trên môi trường thạch. Xác định tính thuần khiết của mẫu và loại bỏ những tạp chất không mong muốn.

* Để khẳng định tính độc lực của mẫu thử, thí nghiệm có thể được thực hiện bằng cách tiêm vào động vật. Mỗi mẫu thử sẽ được sử dụng để tiêm vào 2 con chuột nhắt trắng, với cân nặng từ 18g đến 20g, dưới da bụng của chuột bằng 0,1 ml dịch cấy được mô tả trong phần 9.2 của tiêu chuẩn.

- Thường thì sau khoảng từ 12 đến 24 giờ, các con chuột sẽ bắt đầu phát hiện triệu chứng như suy giảm sức khỏe, lưng còng, và lông rụng. Trong khoảng thời gian từ 24 đến 96 giờ sau tiêm, các con chuột có thể chết. Bệnh tích sẽ xuất hiện dưới da và có thể thấy thủy thũng ở vùng tiêm, lách sưng. Nếu cần, có thể tiến hành kiểm tra lại hình dạng của vi khuẩn, các đặc tính sinh trưởng và thực hiện thử phản ứng lắng cặn (thử phản ứng Ascoli) để xác định tính chất của mẫu thử.

- Chú thích 1: Đối với mẫu thử, có thể sử dụng huyễn dịch với tỉ lệ từ 1:5 đến 1:10 với liều tiêm gấp đôi so với canh trùng. Tăng cường hiệu quả của quá trình tiêm và phân phối mẫu thử một cách đồng đều hơn trong đối tượng nghiên cứu.

- Chú thích 2: Nếu mẫu thử gây nghi ngờ về sự nhiễm tạp khuẩn, có thể thực hiện phương pháp rạch da chuột, xát mẫu thử hoặc canh khuẩn lên chỗ rạch thay vì tiêm dưới da. Giảm thiểu nguy cơ nhiễm khuẩn và đảm bảo tính chính xác của kết quả thử nghiệm.

- Chú thích 3: Đối với các lô chuột chết sau khi tiêm mẫu nước, rơm, hoặc cỏ, cần thực hiện thử phản ứng lắng cặn (phản ứng Ascoli). Giúp xác định và đánh giá mức độ nhiễm bẩn trong mẫu và đảm bảo tính chất của quá trình thử nghiệm.

* Để thực hiện thử nghiệm khẳng định bằng phản ứng lắng cặn (phản ứng Ascoli), quy trình có thể được mô tả như sau:

- Chuẩn bị mẫu thử (kháng nguyên):

+ Sản phẩm tươi sống: Sử dụng cân để cân từ 5g đến 10g mẫu thử, sau đó nghiền mẫu thành dạng nhuyễn bằng dụng cụ nghiền phòng thử nghiệm. Tiếp theo, pha loãng mẫu bằng nước muối đẳng trương theo tỷ lệ từ 1:5 đến 1:10 và đun sôi trong khoảng thời gian từ 15 đến 30 phút. Sau đó, lọc mẫu qua giấy lọc để thu được dung dịch.

+ Sản phẩm khác (các sản phẩm khác của động vật): Sử dụng cân để cân từ 5g đến 10g xương, sừng, lông hoặc diện tích da từ 15 cm2 đến 25 cm2. Tiếp theo, hấp ướt mẫu ở nhiệt độ 102°C trong khoảng thời gian từ 30 đến 60 phút. Sau khi hấp, để mẫu nguội rồi cắt nhỏ hoặc nghiền vụn. Tiếp theo, hòa trộn mẫu với nước muối đẳng trương theo tỷ lệ từ 5 phần đến 10 phần và đun sôi trong khoảng thời gian từ 15 đến 30 phút. Lọc mẫu qua giấy lọc để thu được phần dung dịch trong.

- Cách tiến hành:

+ Sử dụng ống nghiệm cỡ nhỏ hoặc ống nghiệm chuyên dụng đã được chuẩn bị sẵn với 0,5 ml huyết thanh lắng cặn. Sử dụng pipet Pasteur để lấy 0,5 ml kháng nguyên và nhỏ từ từ vào ống nghiệm chứa huyết thanh lắng cặn. Quan trọng là nhớ giữ cho kháng nguyên không bị hòa tan vào huyết thanh, tạo ra một đường ranh giới rõ ràng giữa hai dung dịch. Mỗi lần tiến hành kiểm tra, cần phải có 2 ống đối chứng, một dương tính và một âm tính, để so sánh kết quả.

+ Đọc kết quả sau khoảng thời gian từ 1 đến 15 phút. Nếu xuất hiện một đường ranh giới màu trắng đục, chỉ ra rằng kết quả là dương tính.

Ngoài ra, có thể tham khảo: Thủ tục đăng ký bảo hộ nhãn hiệu cho sản phẩm thịt lợn. Còn khúc mắc, liên hệ 1900.6162 hoặc gửi email tới: lienhe@luatminhkhue.vn để được hỗ trợ. Xin cảm ơn.